УДК 574.23: 577.218: 616-092.19
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К ГИПОКСИИ
Ким А.Е.
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны России,
Россия, г. Санкт-Петербург
alexpann@mail.ru
Аннотация: Исследование выполнено на беспородных белых лабораторных крысах. Для проведения исследования предварительно животные были тестированы на индивидуальный уровень устойчивости к гипоксии. У всех животных отбирались цельная кровь, плазма, ткани сердца, печени, почек, головного мозга, в которых методом Real-Time-PCR определялась экспрессия генов HIF-1α и TSPO (ген «домашнего хозяйства»). Установлено, что уровень устойчивости животных к гипоксии в существенной степени определяется их генетическими особенностями. Высокий уровень базовой экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α в повседневных (нормоксических) условиях может быть предиктором высокого уровня устойчивости данного животного к гипоксии. Анализ реакции системы геномной регуляции на экстремальное воздействие показал, что она в 1,6-2 раза повышает экспрессию гена TSPO в равной степени во всех тканях, независимо от уровня устойчивости животных.
Ключевые слова: гипоксия, гипоксия-индуцибельный фактор, HIF-1α, TSPO, индивидуальный уровень устойчивости, Real-Time-PCR.
ОРГАНИЗМДИН ГИПОКСИЯГА КАРШЫЛЫГЫНЫН ГЕНЕТИКАЛЫК МЕХАНИЗМДЕРИ
Ким А.Е.
C.M. Киров атындагы Аскердик медициналык академиясы, Россиянын коргоо министрлиги, Россия, Санкт-Петербург ш.
alexpann@mail.ru
Аннотация: Изилдөө лабораториялык ак келемиштерге жасалган. Изилдөөлөрдү жүргүзүү үчүн жаныбарлардын гипоксияга туруктуулугунун жеке деңгээли текшерилген. Бардык жаныбарлардан кан, плазма, жүрөктүн ткандары, боор, бөйрөк жана мээ ткандары чогултулуп, анда HIF-1α жана TSPO гендердин экспрессиясы ("үй чарбасы" гени) Real-Time-PCR аркылуу аныкталган. Жаныбарлардын гипоксияга туруктуулугунун деңгээли көбүнчө алардын генетикалык өзгөчөлүктөрү менен аныктала тургандыгы аныкталган. Күнүмдүк (нормоксиялык) шарттарда HIF-1α транскрипция факторунун базалдык экспрессиясынын жогорку деңгээли, бул жаныбардын гипоксияга туруктуулугунун алдын ала көрсөткүчү болушу мүмкүн. Геномдук жөнгө салуу системасынын экстремалдык таасирге реакциясын талдоо, жаныбарлардын туруктуулугунун деңгээлине карабастан, TSPO генинин экспрессиясын бардык ткандарда бирдей 1,6-2 эсеге жогорулата тургандыгын көрсөттү.
Негизги сөздөр: гипоксия, гипоксия-индукциялоочу фактор, HIF-1α, TSPO, каршылыктын жеке деңгээли, реалдуу убакытта-ПТР.
GENETIC MECHANISMS OF RESISTANCE OF THE ORGANISM TO HYPOXIA
Kim A.E.
Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation, St. Petersburg alexpann@mail.ru
Abstract: The study was performed on outbred white laboratory rats. To conduct the study, the animals were preliminarily tested for their individual level of resistance to hypoxia. Whole blood, plasma, heart, liver, kidney, and brain tissues were collected from all animals, in which the expression of the HIF-1α and TSPO genes (the "housekeeping" gene) was determined using the Real-Time-PCR method. It was found that the level of resistance of animals to hypoxia is largely determined by their genetic characteristics. A high level of basal expression of the transcription factor HIF-1α under everyday (normoxic) conditions can be a predictor of a high level of resistance of a given animal to hypoxia. Analysis of the response of the genomic regulation system to extreme exposure showed that it increases the expression of the TSPO gene by 1.6-2 times equally in all tissues, regardless of the level of resistance of the animals.
Keywords: hypoxia, hypoxia-inducible factor, HIF-1α, TSPO, individual resistance level, Real-Time-PCR.
Введение
Одним из ключевых транскрипционных регуляторов, определяющих устойчивость клеток организма к гипоксии, является гипоксия-индуцибельный фактор HIF-1α, вовлеченный в индукцию транскрипции генов гликолиза и транспортеров глюкозы, гемопоэза, ангиогенеза, образования оксида азота, антиоксидантной защиты, работы клеток эндотелия, надпочечников, адренорецепторов, ростковых факторов, процессов апоптоза регенерации. Свойства HIF-1 достаточно подробно рассмотрены в ряде обзоров [1–5].
Известно, что в условиях экстремального гипоксического состояния (кратковременное пребывание крыс среднеустойчивой линии Wistar на высоте 12 км) происходит статистически достоверное повышение экспрессии HIF-1 в почках и сердце и снижение в органах, где экспрессия этого транскрипционного фактора в условиях нормоксии была повышенной – а именно в мозге и печени. Причем, в менее экстремальных условиях (высота 8-11 км) его экспрессия в печени повышалась, а в тканях мозга снижение в разной степени отмечалось в широком диапазоне высот – от 6 до 12 км [6].
Устойчивость организма к гипоксии во многом определяет и устойчивость к другим критически значимым воздействиям (гипертермия, гипотермия, гипербария, ионизирующие излучения, химические вещества и др.) [7–9]. Однако количественной оценки этого влияния в изученной нами литературе обнаружить не удалось, что послужило основанием для выполнения данного исследования.
Цель исследования: оценить количественный вклад уровня экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α в различных тканях лабораторных животных в повышение устойчивости животных к воздействию экстремальной гипоксической гипоксии.
Материалы и методы исследования
В исследовании использовались здоровые нелинейные белые крысы-самцы с массой тела на начало исследования 180-220 г. Животные содержались в соответствии с ГОСТ 33044-2014 от 01.08.2015 «Принципы надлежащей лабораторной практики» в условиях сертифицированного вивария.
Прошедшие 14-недельный карантин белые беспородные крысы в фоновом исследовании предварительно тестировались на устойчивость к гипоксии по критерию резервного времени при воздействии предельно переносимой гипоксической гипоксии. Для тестирования индивидуального уровня устойчивости к гипоксии животные подвергались барокамерному гипоксическому воздействию путем подъема в барокамере на высоту 11500 м. Регистрируемый показатель – время появления второго агонального вдоха (резервное время, Тр), после чего животное «спускалось» с той же скоростью до уровня нормобарии. Для низкоустойчивых животных показатель резервного времени составлял менее 3 минут, для высокоустойчивых он должен быть более 9 минут. Предварительное тестирование позволило сформировать 4 экспериментальные группы по 5 животных, из них две группы (1 и 3) включали в себя животных с низким уровнем устойчивости к гипоксии, и две (2 и 4) – с высоким уровнем устойчивости. Через 12-15 дней после тестирования исходного уровня устойчивости к гипоксии анализировалась экспрессия исследуемых генов HIF-1α и TSPO в образцах тканей лабораторных животных (плазма, цельная кровь, почки, печень, сердце и головной мозг), осуществлялся забор биологического Материалыа для ПЦР-исследования. У животных групп 1 и 2 образцы тканей забирались в нормоксических условиях (без гипоксического воздействия), в группах 3 и 4 – сразу после прекращения воздействия на животных умеренной гипобарической гипоксии. Из исследуемого Материалыа выделяли тотальную РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля согласно протокола производителя к комплекту реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического Материалыа «АмплиПрайм РИБО-сорб» («ИнтерЛабСервис», г. Москва).
Амплификацию, с последующим определением уровня экспрессии гена HIF-1α крыс, проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора CFX-96 («Bio-Rad», США) и специфических праймеров и зондов к гену HIF-1α крыс («ДНК-Синтез», Россия). Праймеры для последовательностей HIF-1α и TSPO (гену «домашнего хозяйства») были подобраны с помощью программы Vector NTI.
Количество исследуемых кДНК (копийных ДНК, полученных из РНК путем обратной транскрипции) в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР. Для оценки уровня экспрессии гена HIF-1α в качестве стандарта сравнения использовался ген TSPO, экспрессия которого считается стабильной для животного. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе проводилась с помощью отношения HIF-1α/TSPO.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась в программной среде процессора таблиц Excel с помощью пакета прикладных программ «Анализ данных» методом дисперсионного анализа ANOVA. Различия между группами оценивались по F-критерию при уровне значимости p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Определения экспрессии генов HIF-1α и TSPO в полярных по уровню устойчивости к гипоксии группах животных представлены в табл. 1-2.
Анализ данных таблиц 1-3 показывает, что уровень устойчивости животных к гипоксии в существенной степени определяется их генетическими особенностями. Даже в условиях нормоксии экспрессия гена TSPO «домашнего хозяйства» животных с высоким уровнем устойчивости к гипоксии с высокой степенью достоверности различается от низкоустойчивых животных (в почках, печени и мозге – в среднем на 40-50%, в сердце – на 25%). Важно, что даже
Таблица 1
Экспрессия генов TSPO в разных тканях в нормоксических условиях и после воздействия гипобарической гипоксии у животных с разным уровнем устойчивости к гипоксии (тысяч копий, M ± m)
|
Ткань |
Нормоксия (высота 0 м) |
Умеренная гипоксия (высота 7000 м) |
||||
|
НУ |
ВУ |
различия |
НУ |
ВУ |
различия |
|
|
Плазма крови |
3,2 ± 0,7 |
7,2 ± 0,6 |
+125%, р=0,002 |
5,6 ± 1,0 |
15,0 ± 0,9 |
+167%, р=2*10-4 |
|
Цельная кровь |
165 ± 5 |
293 ± 6 |
+78%, р=1*10-4 |
325 ± 13 |
581 ± 18 |
+78%, р=5*10-6 |
|
Почки |
3440 ± 53 |
5122 ± 57 |
+49%, р=3*10-8 |
6881 ± 134 |
10205 ± 88 |
+48%, р=2*10-7 |
|
Печень |
980 ± 35 |
1490 ± 21 |
+52%, р=9*10-6 |
1967 ± 42 |
3383 ± 151 |
+72%, р=4*10-4 |
|
Сердце |
2300 ± 55 |
2780 ± 34 |
+21%, р=2*10-4 |
4597 ± 58 |
5613 ± 50 |
+22%, р=1*10-6 |
|
Мозг |
247 ± 13 |
351 ± 6 |
+42%, р=5*10-4 |
495 ± 29 |
719 ± 26 |
+45%, р=4*10-4 |
Примечание: группы животных – НУ – низкоустойчивые к гипоксии, ВУ – высокоустойчивые к гипоксии.
значения экспрессии этого гена, определяемого в цельной крови или плазме, позволяет дифференцировать группы животных по уровню устойчивости к гипоксии. Анализ реакции системы геномной регуляции на гипоксическое воздействие показал, что подъем животных на высоту 7000 м в 2 раза повышает экспрессию гена TSPO в равной степени во всех тканях, независимо от уровня устойчивости животных к гипоксии (единственным исключением стала экспрессия этого гена в печени – в условиях гипоксии она выросла несколько в большей степени
Таблица 2
Экспрессия генов HIF-1α в разных тканях в нормоксических условиях и после воздействия гипобарической гипоксии у животных с разным уровнем устойчивости к гипоксии (тысяч копий, M ± m)
|
Ткань |
Нормоксия (высота 0 м) |
Умеренная гипоксия (высота 7000 м) |
||||
|
НУ |
ВУ |
различия |
НУ |
ВУ |
различия |
|
|
Плазма крови |
0,6 ± 0,1 |
6,1 ± 0,6 |
+820%, р=5*10-4 |
0,4 ± 0,1 |
29,6 ± 2,2 |
+597%, р=2*10-4 |
|
Цельная кровь |
104 ± 2 |
328 ± 7 |
+215%, р=2*10-6 |
6802 ± 582 |
18586 ± 1151 |
+173%, р=1*10-4 |
|
Почки |
1924 ± 49 |
6338 ± 53 |
+229%, р=7*10-12 |
6001 ± 62 |
9735 ± 774 |
+62%, р=8*10-3 |
|
Печень |
11385 ± 399 |
29030 ± 117 |
+155%, р=3*10-7 |
97692 ± 1953 |
228238 ± 12419 |
+133%, р=4*10-4 |
|
Сердце |
4940 ± 326 |
9785 ± 216 |
+98%, р=6*10-6 |
10057 ± 170 |
23185 ± 215 |
+130%, р=1*10-10 |
|
Мозг |
50583 ± 2722 |
121308 ± 4362 |
+140%, р=4*10-6 |
171393 ± 8220 |
32663 ± 1428 |
-80%, р=5*10-5 |
Примечание: группы животных – НУ – низкоустойчивые к гипоксии, ВУ – высокоустойчивые к гипоксии.
– в 2,27 раза). Для гена HIF-1α обнаружены аналогичные закономерности, но выраженность их проявлений имеет более существенный (в 2-2.5 раза для условий нормоксии и в 1,6 - 2,3 раза для условий гипоксии) и достоверный характер.
Для финальной оценки экспрессии гена HIF-1α было выполнено их нормирование по экспрессии гена «домашнего хозяйства» TSPO (табл. 3).
Таблица 3
Уровень экспрессии генов HIF-1α в разных тканях в нормоксических условиях и после воздействия гипобарической гипоксии у животных с разным уровнем устойчивости к гипоксии, нормированный по активности гена TSPO (отн. ед., M±m)
|
Ткань |
Нормоксия (высота 0 м) |
Умеренная гипоксия (высота 7000 м) |
||||
|
НУ |
ВУ |
различия |
НУ |
ВУ |
различия |
|
|
Плазма крови |
0,21 ± 0,01 |
0,84 ± 0,0,01 |
+306%, р=2*10-9 |
0,08 ± 0,01 |
1,96 ± 0,05 |
+2360%, р=5*10-7 |
|
Цельная кровь |
0,63 ± 0,01 |
1,12 ± 0,01 |
+77%, р=2*10-9 |
20,8 ± 1,2 |
32,0 ± 1,8 |
+54%, р=1*10-3 |
|
Почки |
0,56 ± 0,04 |
1,24 ± 0,02 |
+121%, р=4*10-9 |
0,87 ± 0,02 |
0,96 ± 0,08 |
+9%, р=0,39 |
|
Печень |
11,62 ± 0,08 |
19,50 ± 0,30 |
+68%, р=4*10-6 |
49,7 ± 0,2 |
67,4 ± 0,8 |
+35%, р=1*10-5 |
|
Сердце |
2,14 ± 0,09 |
3,52 ± 0,04 |
+64%, р=1*10-5 |
2,19 ± 0,03 |
4,13 ± 0,06 |
+89%, р=2*10-7 |
|
Мозг |
205 ± 4 |
345 ± 7 |
+68%, р=9*10-7 |
347 ± 5 |
45,4 ± 1,1 |
-87%, р=2*10-7 |
Примечание: группы животных – НУ – низкоустойчивые к гипоксии, ВУ – высокоустойчивые к гипоксии.
Для низкоустойчивых к гипоксии животных накопление фрагментов HIF-1α в тесте ПЦР выше, чем для высокоустойчивых. В принципиальном плане отличается реакция на гипоксию для экспрессии HIF-1α в тканях мозга: повышение в 3,5 раза для группы неустойчивых животных и снижение в 3 раза для высокоустойчивых. Такая реакция экспрессии HIF-1α в мозге на гипоксию ранее была описана в работе [6] для группы, не дифференцированной по уровню устойчивости к гипоксии животных.
Представленные данные свидетельствуют, что основным органом, обеспечивающим высокий уровень устойчивости к гипоксии, связанный с базовой (в условиях нормоксии) экспрессией HIF-1α, является головной мозг. Экспрессия в нем гипоксия-индуцибельного фактора более чем в 300 раз превышает экспрессию генов «домашнего хозяйства». Вторым по значимости органом является печень, активность экспрессии в которой HIF-1α более чем 15 раз превышает экспрессию генов «домашнего хозяйства».
Заключение:
Высокий уровень базовой экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α в повседневных (нормоксических) условиях может быть предиктором высокого уровня устойчивости данного животного к гипоксии. Для повышения устойчивости организма к экстремальным воздействиям целесообразно использовать медицинские технологии, повышающие уровень экспрессии HIF-1α в повседневных (нормоксических) условиях в ключевых тканях – головном мозге, печени, миокарде.
Литература:
1. Джалилова, Д. Ш. Роль HIF-фактора, индуцируемого гипоксией, в механизмах старения / Д. Ш. Джалилова, О. В. Макарова // Биохимия. – 2022. – Т. 87. – № 9. – С. 1277-1300. – DOI: 10.31857/S0320972522090081.
2. Гипоксией индуцируемый фактор (HIF): структура, функции и генетический полиморфизм / А. Г. Жукова, А. С. Казицкая, Т. Г. Сазонтова, Н. Н. Михайлова // Гигиена и санитария. – 2019. – Т. 98. – № 7. – С. 723-728. – DOI: 10.18821/0016-9900-2019-98-7-723-728.
3. Любимов, А. В. Участие HIF-1 в механизмах нейроадаптации к острому стрессогенному воздействию / А. В. Любимов, П. П. Хохлов // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2021. – Т. 19. – № 2. – С. 183-188. – DOI: 10.17816/rcf192183-188.
4. Ke, Q. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) / Q. Ke, M. Costa // Molecular Pharmacology. – 2006. – Vol. 70. – № 5. – P. 1469-1480. – DOI: 10.1124/mol.106.027029.
5. Pugh, C. W. Modulation of the Hypoxic Response. / C. W. Pugh // Advances in experimental medicine and biology. – 2016. – Vol. 903. – P. 259-71. – DOI: 10.1007/978-1-4899-7678-9_18.
6. Экспрессия гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1α как критерий развития гипоксии тканей / Е. Б. Шустов, Н. Н. Каркищенко, М. С. Дуля [и др.] // Биомедицина. – 2015. – № 4. – С. 4-15.
7. Hyperthermia accelerates neuronal loss differently between the hippocampal CA1 and CA2/3 through different HIF-1α expression after transient ischemia in gerbils / T. K. Lee, D. W. Kim, H. Sim [et al.] // International Journal of Molecular Medicine. – 2022. – Vol. 49. – № 4. – P. 55. – DOI: 10.3892/ijmm.2022.5111.
8. NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species production activates hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) via the ERK pathway after hyperthermia treatment / E. J. Moon, P. Sonveaux, P. E. Porporato [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2010. – Vol. 107. – № 47. – P. 20477-20482. – DOI: 10.1073/pnas.1006646107.
9. Hyperthermia-conditioned OECs serum-free-conditioned medium induce NSC differentiation into neuron more efficiently by the upregulation of HIF-1 alpha and binding activity / L. Wang, M. Jiang, D. Duan [et al.] // Transplantation. – 2014. – Vol. 97. – № 12. – P. 1225-1232. – DOI: 10.1097/TP.0000000000000118.